基因型

F-, Φ80ΔlacM15, thi, lac-, mtl-, recA+,KmR

簡(jiǎn)要說(shuō)明

M15(pREP4)蛋白表達(dá)菌株含有pREP4質(zhì)粒，該質(zhì)粒通過(guò)p15A復(fù)制子啟動(dòng)復(fù)制，可以與許多原核表達(dá)質(zhì)粒共存于同一大腸桿菌細(xì)胞中；同時(shí)該質(zhì)粒攜帶lac I基因，可高效表達(dá)lac抑制蛋白，在IPTG誘導(dǎo)前可抑制目標(biāo)蛋白的本底表達(dá)，特別適合毒性基因的表達(dá)。M15(pREP4)菌株是PQE系列質(zhì)粒的配套菌株，特別適合PQE系列質(zhì)粒或由E.coli T5 啟動(dòng)子誘導(dǎo)表達(dá)的質(zhì)粒的蛋白表達(dá)。pREP4質(zhì)粒賦予該菌株ka那霉素抗性。M15(pREP4)感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，pUC19質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率達(dá)2×108cfu/μg DNA。

操作說(shuō)明

1、M15(pREP4)感受態(tài)細(xì)胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，5分鐘后待菌塊融化，加入目的質(zhì)粒并用手撥EP管底混勻，冰中靜置25分鐘。 

2. 42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰上并靜置2分鐘，晃動(dòng)會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。 

3. 向離心管中加入700 μl不含抗生素的無(wú)菌培養(yǎng)基(LB)，混勻后37℃，200 rpm復(fù)蘇60分鐘。

4. 5000 rpm離心一分鐘收菌，留取50 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基上（若質(zhì)粒濃度較高，也可稀釋后涂板，務(wù)必保證能在平板上挑到單克隆菌落）。

5. 將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)，M15(pREP4)菌株在平板或液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，需在培養(yǎng)基中加入終濃度為35ug/ml的ka那霉素。

注意事項(xiàng)

1、感受態(tài)細(xì)胞最好在冰中緩慢融化，插入冰中8分鐘內(nèi)加入目標(biāo)DNA，不可在冰中放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，長(zhǎng)時(shí)間存放會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。

2. M15(pREP4)菌株在平板或液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，需在培養(yǎng)基中加入終濃度為35ug/ml的ka那霉素。

3. 轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少最終用于涂板的菌量。

4. 為獲得需要量的蛋白，最佳誘導(dǎo)時(shí)間，溫度，IPTG濃度需實(shí)驗(yàn)者優(yōu)化。